DNAフラグメントの精製DNA Fragment Purification

アガロースゲルを用いた電気泳動によるDNAの分離

DNA separation by agarose gel electrophoresis

1. 切り出し用のアガロースゲルを作製する（コームが太い方でゲルを作る）。Prepare an agarose gel for extraction (use the wide comb).
2. 1 wellあたり20 µL程度アプライ出来るので、DNA溶液の量は15 µL程度が望ましい。つまり、DNA溶液15 µLにBPBやXCの5xDyeを3 µL程度入れ、18 µL程度の液量にしておけば、全量を1 wellにアプライできる。Each well holds ~20 µL; use ~15 µL of DNA solution. Mix 15 µL DNA with ~3 µL of 5× loading dye (BPB or XC) to reach ~18 µL total, which can be loaded into one well.
3. 電気泳動を15〜20分程度行い、DNAの各フラグメントを分離する。Run electrophoresis for 15–20 minutes to separate DNA fragments.

ゲルからの切り出し

Gel excision

1. 電気泳動の終わったゲルを緑色LEDライト点灯化でバンドを可視化させて、清浄なメスにより切り出す。（もし、PCR産物が単一バンドならこのステップは省略可能）Visualize bands under green LED light and excise the target band with a clean scalpel. (Skip this step if the PCR product shows a single band.)

ゲルから切り出したDNAフラグメントの精製
Gel and PCR Clean up Kit (Macherey-Nagel)を用いて行う

Purification of excised DNA fragments
Using the Gel and PCR Clean-up Kit (Macherey-Nagel)

1. 空チューブで0合わせをして、切り出したゲルの重さを量る。Tare an empty tube, then weigh the excised gel slice.
2. 添付試薬NTIをゲル重量の2倍量（2%以上のゲルなら4倍量）を加え、50℃で2, 3分間シェイキングしながら加熱処理し、完全に可液化させる。2, 3分経っても可溶化していなければ、もっと時間をかける。Add 2× gel weight of buffer NTI (4× for gels ≥2%) and heat at 50 °C for 2–3 min with shaking until completely dissolved. Extend the time if not fully dissolved.
3. 可溶化液をNucleoSpinカラムに添加し、11,000xgで10-30秒間遠心する。Load the dissolved solution onto the NucleoSpin column and centrifuge at 11,000 × g for 10–30 s.
4. パススルー液を捨て、カラムに添付試薬NT3（最初に使用し始める時にエタノールを200 mL入れる）を700 µL入れ、11,000xgで10-30秒間遠心する。Discard the flow-through. Add 700 µL of buffer NT3 (add 200 mL ethanol at first use) to the column and centrifuge at 11,000 × g for 10–30 s.
5. 4.をもう一回行う。Repeat step 4.
6. パススルー液を捨て、何も加えずに11,000xgで1分間遠心することで、カラムを乾燥させる。Discard the flow-through and centrifuge at 11,000 × g for 1 min (no additions) to dry the column membrane.
7. カラムを新しい1. 5 mlチューブに移し、添付試薬NE 30 µLを膜の中心部に滴下し、１分間静置する（複数サンプルがある時はチップを交換する。）。Transfer the column to a new 1.5 mL tube, pipette 30 µL of buffer NE onto the center of the membrane, and let stand for 1 min (change tips between samples if processing multiple).
8. 11,000xgで１分間、遠心し、DNAフラグメントを溶出させる。Centrifuge at 11,000 × g for 1 min to elute the DNA fragments.