TAクローニング

PCR産物の3'末端へのdATP付加反応

1. Taq DNA polymeraseが持つTdT活性を利用してdATPを3’末端に付加させる。
2. PCR産物をDNAフラグメント精製により精製する。
3. ゲルから切り出して精製したPCR産物を以下の組成で混合する。使用するTaqはインサートチェック用のgreiner Taqを用いる（理由は安いから。）。
4. サーマルサイクラーで70℃90分反応させる

• PCR products	7.8 µL
  10xgreiner Taq Buffer	1 µL
  Taq DNA polymerase	0.2 µL

Tベクターとのライゲーション
TaKaRaのDNA Ligation Kit <Mighty Mix>を用いる。

1. DNA Ligation Kitを氷水の中で融解 (5～10分)し、スピンダウンする。
2. 0.2 mlチューブまたは1.5 mlチューブに5 µl DNA Ligation Kitを入れる。この時、軽いピペッティングにより軽く混ぜる。
3. 17 ng/µl（原液; 50 ng/µl,を滅菌MQで3倍希釈）に希釈されているTベクター（pGEM T-EasyまたはpMD20）を1 µl 入れる。
4. A付加したPCR産物を4 µl 入れる。
5. サーマルサイクラーで16℃、30分または4℃、オーバーナイトで反応させる。
6. この後、ライゲーション産物をトランスフォーメーションする。