TAクローニングTA Cloning

PCR産物の3’末端へのdATP付加反応

dATP addition to the 3′ end of PCR products

1. Taq DNA polymeraseが持つTdT活性を利用してdATPを3’末端に付加させる。Use the TdT activity of Taq DNA polymerase to add dATP to the 3′ end.
2. PCR産物をDNAフラグメント精製により精製する。Purify the PCR product using the DNA fragment purification protocol.
3. ゲルから切り出して精製したPCR産物を以下の組成で混合する。使用するTaqはインサートチェック用のgreiner Taqを用いる（理由は安いから。）。Mix the gel-purified PCR product as described in the table below. Use Greiner Taq (the cheaper option used for insert checking).
4. サーマルサイクラーで70℃90分反応させるReact at 70 °C for 90 min in a thermal cycler.

• PCR products	7.8 µL
  10xgreiner Taq Buffer	1 µL
  Taq DNA polymerase	0.2 µL

Tベクターとのライゲーション
TaKaRaのDNA Ligation Kit <Mighty Mix>を用いる。

Ligation into T-vector
Using TaKaRa DNA Ligation Kit <Mighty Mix>.

1. DNA Ligation Kitを氷水の中で融解 (5～10分)し、スピンダウンする。Thaw the DNA Ligation Kit in ice water (5–10 min) and spin down.
2. 0.2 mlチューブまたは1.5 mlチューブに5 µl DNA Ligation Kitを入れる。この時、軽いピペッティングにより軽く混ぜる。Add 5 µL of the DNA Ligation Kit to a 0.2 mL or 1.5 mL tube and mix gently by pipetting.
3. 17 ng/µl（原液; 50 ng/µl,を滅菌MQで3倍希釈）に希釈されているTベクター（pGEM T-EasyまたはpMD20）を1 µl 入れる。Add 1 µL of T-vector (pGEM T-Easy or pMD20) diluted to 17 ng/µL (stock: 50 ng/µL, dilute 3-fold with sterile MQ water).
4. A付加したPCR産物を4 µl 入れる。Add 4 µL of the A-tailed PCR product.
5. サーマルサイクラーで16℃、30分または4℃、オーバーナイトで反応させる。React at 16 °C for 30 min or at 4 °C overnight in a thermal cycler.
6. この後、ライゲーション産物をトランスフォーメーションする。Proceed to transformation of the ligation product.